Dotaz

Na úvod si připomeňme, že molekulu DNA tvoří dvě vlákna stočená do dvojité šroubovice. Vlákna jsou vlastně řetězce vzniklé spojením stavebních kamenů označovaných jako nukleotidy. V DNA najdeme čtyři druhy nukleotidů – liší se od sebe částí nazývanou báze (tou může být adenin, guanin, cytosin nebo thymin).

Tato čtyři „písmena“ slouží organismům k zápisu genetické informace. Když chceme genetickou informaci „přečíst“, musíme DNA sekvenovat – zjistit pořadí nukleotidů v jejích vláknech.

Takzvané sekvenování první generace využívá upravenou Sangerovu metodu. Její původní verzi publikoval Frederick Sanger v roce 1975 a následně za ni získal Nobelovu cenu. Před samotným „čtením“ DNA se musí zkoumaný úsek dostatečně namnožit na takové množství, které je detekovatelné v přístroji.

Následuje sekvenační reakce, při níž se DNA ještě jednou namnoží, tentokrát ale v přítomnosti označených nukleotidů. Nukleotidy se značí speciálními fluorescenčními barvivy, která světélkují po ozáření světlem, v tomto případě laserem o vlnové délce 488 nanometrů. Při reakci vznikne směs různě dlouhých úseků DNA (fragmentů) zakončených vždy jedním z obarvených nukleotidů.

Směs se pak vloží do automatického analyzátoru. Zde probíhá takzvaná elektroforéza – fragmenty putují v elektrickém poli tenoučkými trubičkami (kapilárami), které mají průměr menší než 1 mm. Během dvou hodin projde vzorek kapilárou až před okénko laseru, kde jsou fluorescenční barvičky postupně „rozsvěcovány“ a zaznamenávány supercitlivou kamerou.

Před okénkem procházejí fragmenty srovnané podle délky – nejprve nejkratší, protože ty putují skrz kapiláru nejrychleji, potom delší. Přístroj je nastaven tak, aby zaznamenal postupně všechny fragmenty lišící se svou délkou vždy o jeden nukleotid. Podle záznamu postupně procházejících barviček je pak určeno pořadí nukleotidů. Touto metodou lze přečíst kousky DNA dlouhé asi 1 000 nukleotidů.

Jak dlouho takové sekvenování trvá? Jak jsme si řekli, zkoumaný úsek DNA je potřeba předem namnožit. To zabere několik hodin až dní podle typu materiálu. Dalších několik hodin trvá příprava sekvenační reakce. „Přečtení“ v analyzátoru je pak otázka dvou hodin.

Kompletní genetická informace organismu (odborně jí říkáme genom) je ovšem obrovská. U organismů s buněčným jádrem, jako jsou třeba živočichové a rostliny, obsahuje miliardy „písmen“. Lidský genom se například skládá z více než tří miliard párů nukleotidů. Pomocí klasické metody, kterou jsme si popsali výše, zabralo dříve sekvenování podobného genomu několik let.

V současné době mají vědci naštěstí k dispozici nové metody sekvenování (mluvíme o technologiích druhé generace neboli next generation). Ty přečtou v jednom sekvenačním běhu až desítky či stovky miliard nukleotidů během několika hodin, respektive dnů.

Souběžně probíhá mnoho sekvenačních reakcí, jejichž výsledkem je obrovské množství krátkých úseků DNA. Jednotlivé přečtené úseky se více či méně překrývají a musí se propojit, na což jsou vytvořeny složité algoritmy a matematické postupy. Dnes lze každopádně celý genom člověka osekvenovat za pár dní – a dokonce prý za jediný den.

Sekvenační technologie navíc neustále přibývají a zdokonalují se. Nyní už existuje i sekvenování třetí generace, kdy pro analýzu stačí použít pouze jednu molekulu DNA. Zároveň se snižuje cena sekvenování, které se tak stalo jednou ze základních metod molekulární biologie.

Horní obrázek: Model krátkého úseku dvojité šroubovice DNA. Zdroj Wikimedia Commons, autor Benjah-bmm27, volné dílo / public domain.