Když na rychlosti záleží

Z hlediska vědy jde jistě o něco úžasného, nároky nevděčné medicíny však neznají mezí: „Několik dní?! A za několik hodin by to nešlo?“

Od úvodní k cílené

Pro efektivní cílenou léčbu infekce je zásadní spolehlivá charakterizace původce onemocnění, a biologické vzorky pacientů jsou proto podrobovány mikrobiologické diagnostice. Lékaři v neodkladných případech přistupují k úvodní léčbě infekce, která je zvolena na základě obecných klinických kritérií, aniž by byl znám původce a zohledněna jeho citlivost na různá antibiotika. Dřívější zahájení účinné léčby totiž vede k rychlejšímu uzdravení pacientů, snižují se náklady na jejich pobyt v nemocnici a u závažných stavů, jako je systémová zánětlivá reakce organismu na infekci (sepse), roste šance pacientů na přežití. Teprve později případně dochází na základě výsledků testů k úpravě úvodní léčby na cílenou – přechod na antibiotika cílící na užší spektrum mikroorganismů, nebo naopak nahrazení méně vhodných léčiv účinnějšími. Ovšem jaká doba je k tomu potřeba? A šla by zkrátit?

Standardně, ale pomalu

Mikrobiologická diagnostika začíná příjmem a evidencí vzorku klinickou laboratoří, v přípravné fázi jsou získány čisté kultury patogenů postupy závisejícími na typu vzorků (krev, moč, hlen, …). Ty jsou následně identifikovány a souběžně je testována jejich citlivost na antibiotika. Obojí je pak sděleno ošetřujícímu lékaři – při použití standardních metod obvykle do 36–72 hodin od odběru vzorku.

Celková doba stanovení citlivosti patogenů na antibiotika spadá do širokého intervalu (i v rámci jedné klinické laboratoře), převážně v důsledku nestejné rychlosti a dynamiky růstu různých mikroorganismů určující délku jednotlivých kultivačních kroků. Kultivace trvající 12–24 hodin pro rychle se množící mikroorganismy je prováděna u vzorků s malým počátečním množstvím patogenu (např. krev pacienta se sepsí) nebo tehdy, pokud je nutné nejprve patogen izolovat ze směsi (např. z hlenu pacienta se zánětem dýchacích cest) a poté jej namnožit.

Čistá a dostatečně početná kultura je následně identifikována v řádu několika hodin sekvenací nukleových kyselin nebo v řádu desítek minut pomocí hmotnostněspektrometrické biotypizace. Paralelně je kultura 16–24 hodin kultivována na agarové plotně s papírovými disky obsahujícími antibiotika a následně je z plotny odečten výsledek – souvislý bakteriální povlak porůstá místa bez antibiotika a okolí disků s antibiotiky, vůči kterým je testovaná bakterie rezistentní, zatímco v okolí disků s antibiotiky, na která je bakterie citlivá, je růst potlačen. Obdobnou časovou náročnost má také druhá ze standardních metod, při které jsou bakterie kultivovány v kapalném médiu s různou koncentrací antibiotik na mikrotitrační destičce. Podle jamek, ve kterých není po skončení inkubace spektrometricky detekován bakteriální růst, je určena nejen citlivost na antibiotika, ale i jejich minimální koncentrace, při které již inhibují růst patogenu.

Celkový čas stanovení může dále narůst o prodlevy mezi jednotlivými kroky testování, nebo být naopak zkrácen větší automatizací a také nahrazením stávajících postupů rychlejšími.

Je potřebná „doba letu“?

Bakterie se v novém prostředí (např. po přenosu do média s antibiotikem) nejprve adaptují na změnu a poté se, pokud jim to podmínky dovolují, začnou množit. Antibiotickou rezistenci jsme pak schopni určit v okamžiku, kdy dokážeme zmnožené bakterie detekovat a odlišit tak podmínky, kdy je bakteriální růst inhibován a kdy ne. Pro urychlení testování je proto klíčové zvolit metody detekující již velmi malé počty bakterií. Pro svou vysokou citlivost, rychlost, nízké náklady na změřený vzorek, míru automatizace a schopnost souběžné detekce a identifikace mikroorganismů se jeví výhodnou hmotnostní spektrometrie s matricí asistovanou laserovou desorpcí/ionizací (MALDI) a analyzátorem doby letu (TOF, angl. time of flight).

Obdobně jako v případě standardní metody na mikrotitrační destičce jsou bakterie kultivovány na terčíku v kapkách média s antibiotiky. Médium je však odstraněno již po 4–5 hodinách a jednotlivé pozice s uchycenými bakteriemi jsou převrstveny nízkomolekulární matricí. Ta při měření absorbuje energii laseru, pomáhá převést vzorek do plynné fáze a jeho molekulám (zde bakteriálním proteinům) dodává náboj. Ionty jsou poté urychleny elektrickým potenciálem a je určena doba jejich letu trubicí analyzátoru. Ionty se stejnou počáteční kinetickou energií, ale nižší hmotností získají vyšší rychlost, a dopadnou tedy na detektor dříve než ionty těžší. Výsledkem měření (pokud nebyl růst inhibován) je spektrum se signály odpovídajícími hmotám proteinů charakteristických pro daný mikroorganismus.

Zda se právě tato metoda stane standardem klinické diagnostiky budoucnosti, se teprve ukáže, nicméně studenti Přírodovědecké fakulty mají možnost si ji prakticky vyzkoušet již nyní.